L’effetto di alti livelli di vaccinazione sullo stato immunitario non è stato ancora ben chiarito. In questo studio gli autori hanno usato i vaccini stessi come agente stressore, per meglio comprendere lo stress immunitario nel pollo.
Il virus della malattia di Newcastle (NDV), appartenente al gruppo Paramyxoviridae, è l’agente causale chiave della malattia di Newcastle (ND) che attacca polli, tacchini e altri avicoli. Gli uccelli sopravvissuti hanno mostrato una crescita ridotta, un utilizzo alterato del mangime, una riduzione della produzione di uova e conseguenti gravi perdite economiche. Per alleviare questo effetto negativo sul tasso di crescita e di conversione, l’inoculazione NDV è stata utilizzata per proteggere il pulcino dalla malattia di Newcastle, e questa rappresenta una delle sfide che il broiler affronta per tutta la vita.
Lo stress immunitario, come altre forme di stress, si tramuta più o meno direttamente in due risposte da parte dell’organismo: l’asse ipotalamo-ipofisario-adrenale, che provoca il rilascio di ormoni correlati a corticotropina, ormone adrenocorticotropo e glucocorticoidi, e l’asse simpatico adrenale, che risulta nel rilascio di catecolamine. È noto che il costante rilascio di ormone adrenocorticotropo aumenta il corticosterone plasmatico, il colesterolo e la concentrazione proteica totale. Concentrazioni elevate di corticosterone hanno dato diversi effetti deleteri sulle rese del pollo. Il trattamento con corticosterone, infatti, influenza le scelte alimentari e l’appetito del pollo, in modo inversamente proporzionale al peso. La gluconeogenesi è indotta dal corticosterone, come pure il catabolismo proteico e la deposizione di grasso. Viene anche alterato il meccanismo dell’insulina nel fegato del pollo e pure il muscolo viene influenzato negativamente dal corticosterone, tramite meccanismi vari.
Uno studio effettuato in passato ha mostrato che l’immunizzazione, indotta dalla vaccinazione routinaria, ha diminuito il consumo alimentare, il peso corporeo (BWG) e la digeribilità dei nutrienti, il tutto accompagnato da un’elevata concentrazione plasmatica di IgG. Invece una dose immunizzante di globuli rossi di montone non induce alcuna differenza nel consumo, peso, crescita e metabolizzazione dell’energia grezza nelle pollastre. Dopo un’immunizzazione singola, o comunque limitata, negli avicoli domestici, le crescite non erano alterate, e la risposta immunitaria usava pochi nutrienti. Inoltre, nell’industria avicola moderna i vaccini sono somministrati a un notevole dosaggio e con frequenze elevate, onde ridurre la mortalità, specialmente per i vaccini somministrati per via orale.
L’effetto di alti livelli di vaccinazione sullo stato immunitario, come pure sull’energia e il metabolismo dei nutrienti nel pollo, non è stato ancora ben chiarito. In questo studio gli autori hanno usato i vaccini stessi come agente stressore, onde valutare l’effetto di livelli diversi di virus NDV su rese, metabolismo, risposte immunitarie e caratteristiche delle carcasse di broiler Arbor Acres, per meglio comprendere lo stress immunitario nel pollo.
Metodo
Gestione e trattamenti
Tutti i protocolli sono stati approvati dal comitato per il benessere animale dell’Università del Nordwest. Pulcini Arbor Acres di 1 giorno provenienti dall’incubatoio commerciale Shaanxi Zhengda (Cina) sono stati accasati in un ambiente a temperatura controllata (35-33 °C) per la prima settimana, calando 2 °C a settimana fino al raggiungimento di 24 °C. Mangime e acqua venivano forniti a volontà e si forniva anche luce continua per la durata della prova. Tutte le diete erano formulate per soddisfare o superare le richieste stabilite dal NRC. 8480 pulcini sono stati suddivisi dunque in 4 gruppi, con 6 repliche di 20 soggetti ciascuno. Il peso corporeo iniziale (BW) non dava differenze significative. Il virus della MD è termostabile (La Sota, Bio Industry, Cina) e veniva sciolto con soluzione salina sterile. I pulcini, in buono stato di salute, ricevevano dosi di 4.6 e 8 volte la normale dose di vaccino, a 12 e 28 giorni, per via oculo-nasale e acqua di bevanda (gruppo 4, 6 e 8).
Rese di crescita
Il BW (peso) e il consumo erano registrati settimanalmente e venivano calcolati rispettivamente a 12 e 42 gg.
Raccolta di sangue e peso degli organi
Al giorno 12 e 28 un soggetto da ciascuna replica veniva campionato, per misurare il peso. Venivano raccolti circa 8 ml di sangue e trasferiti in provetta da centrifuga eparinizzata. Una parte del sangue era usata per valutare il rapporto eterofili/linfociti e fare il test di proliferazione linfocitica, mentre l’altra era centrifugata a 2000 g per 10 minuti, per ottenere plasma atto a successive analisi biochimiche. Al giorno 28, tutti i polli sono stati soppressi tramite dislocazione cervicale, dopo un prelievo ematico, per misurare il peso della borsa di Fabrizio, milza e timo. Infine si è calcolato il peso relativo di ciascun organo.
Parametri ematici: misurazioni
Al giorno 12 e 28 si determinava il rapporto eterofili/linfociti secondo la metodica di Zang. In breve, 5 microlitri di sangue erano usati per fare uno striscio su vetrino; poi lo si colorava con Geimsa dopo averlo seccato. Il numero delle cellule era calcolato con microscopio a immersione in olio, con ingrandimento di 100, da personale qualificato. In ciascun campo visivo, si contavano 100 cellule, tra neutrofili ed eterofili, infine si calcolava il rapporto tra essi. La concentrazione di corticosterone plasmatico e insulina era calcolata tramite un test radioimmunologico (RIA) per il corticosterone (ICN, Costa mesa) e l’insulina (Beijin Biolm Tech, Cina). La concentrazione di glucosio plasmatico, proteine totali, colesterolo, trigliceridi e acidi grassi non esterificati veniva determinata con kit commerciali secondo le istruzioni del produttori.
Proliferazione dei linfociti ematici periferici
Il sangue era raccolto a 0, 6, 12, 24 ore ai giorni 2 e 4, dopo la seconda vaccinazione eseguita a 28 giorni, in modo da valutare la variazione della proliferazione linfocitica. I linfociti T e B erano testati secondo la metodica di Zang modificata. Il terreno di separazione dei linfociti (TBD, China) era usato per separare i linfociti. Si usavano lipopolisaccaridi (LPS, Singa) e Concavalina A (Sigma) per indurre la proliferazione dei linfociti B e T rispettivamente. L’assorbanza a 570 nm era registrata tramite in lettore ELISA su micropiastre (Bio Tek USA). L’indice di stimolazione (SI) era calcolato come segue: SI=OD570 (gruppo in prova)/OD570 (gruppo controllo).
Titolo degli anticorpi sierici verso ND
I campioni di sangue erano raccolti dalla vena alare a 6, 10 e 14 gg dalla prima inoculazione e a 5, 9 e 13 gg dalla seconda di NDV. I campioni di siero erano preparati e refrigerati a -80 °C prima dell’analisi. La quantificazione degli anticorpi NDV era fatta con inibizione dell’emoagglutinazione. Il titolo medio geometrico era espresso come valore reciproco della diluizione finale.
Determinazione del sangue intero
Onde valutare il contenuto in materia secca, l’azoto e altri lipidi estraibili in etere corporei, un soggetto per ogni replica era soppresso e spennato prima della prima inoculazione (a 12 gg) e alla fine della prova (42 gg), per valutare la composizione corporea iniziale e finale. Poi la carcassa è stata sminuzzata in piccoli pezzi, passati in una macina (Mig, Cina). Tutti i campioni erano liofilizzati e rimacinati, per renderli omogenei. La materia secca veniva determinata tramite asciugatura a 105 °C per 24h. Azoto e lipidi estraibili con etere erano misurati secondo le procedure dell’associazione di chimica analitica.
Analisi statistica
I dati sono stati valutati secondo uno schema randomizzato che seguiva le procedure GLM tramite SPSs 17,0. Differenze significative tra i trattamenti venivano determinate con il test multiplo di Duncan e P<0,05 era considerato statisticamente significativo.
Risultati
Performance di crescita
Rispetto al gruppo di controllo, il trattamento con NDV diminuiva significativamente il peso a tutte le dosi a 1-21 g (P<0,05), mentre era significativo a 21-42 gg e a 1-42 gg (P>0,05). Il rapporto risultava significativamente inferiore nei gruppi a 4 e 6 dosi a 21-41 gg. Nel corso di tutta la prova, il gruppo a 6 dosi mostrava un rapporto inferiore del 6,3% (P<0,05). Nessun’altra differenza significativa si evidenziava invece tra tutti i trattamenti circa il consumo di mangime per tutti i periodi sperimentali (P<0,05). Circa il peso di borsa di Fabrizio, timo e milza, non risultavano differenze significative tra i trattamenti.
Parametri plasmatici del rapporto eterofili/linfociti
Dopo la prima inoculazione a 12 g, il corticosterone plasmatico aveva un aumento della concentrazione nel gruppo a 8 dosi rispetto alle 4, e la concentrazione insulinica plasmatica risultava inferiore in tutti i gruppi trattati con NDV. Comunque, non si trovavano differenze significative nella concentrazione di corticosterone plasmatico ed insulina, tra tutti i gruppi, dopo la seconda inoculazione a 28 gg. La concentrazione di glucosio plasmatico, proteine totali, colesterolo, trigliceridi, acidi grassi non esterificati, non risultava alterata dall’inoculazione. Il rapporto eterofili/linfociti tendeva ad aumentare con la dose inoculante di NDV, ma le differenze non erano significative.
Proliferazione del titolo anticorpale e proliferazione linfocitaria
L’immunizzazione NDV elevava significativamente il titolo anticorpale 10 giorni dopo la prima inoculazione e 5, 9 e 13 giorni dopo la seconda. Il titolo degli anticorpi NDV tendeva ad aumentare 14 gg dopo la prima inoculazione, ma non in modo significativo. La proliferazione di linfociti B e T non risultava influenzata dalla seconda inoculazione effettuata a 28 gg. L’indice di stimolazione a 4 gg ritornava a concentrazioni non diverse da quelle fatte un’ora dopo la prima inoculazione.
Contenuto di nutrienti corporeo
Il contenuto corporeo di acqua, proteina e lipidi non era influenzato dalla inoculazione di NDV. L’aumento del tasso di nutrienti era parimenti inalterato dalla immunizzazione con NDV a 21-42 gg.
Discussione
Lo stress si concretizza in diverse forme e il risultato è il rilascio di ormoni; lo stress fisiologico pare riduca il peso e la conversione. In questa prova, un trattamento con NDV mostrava una riduzione di peso e conversione rispetto ai gruppi di controllo non inoculati a 1-21 gg. L’assenza di un aumento del corticosterone dopo la seconda inoculazione a 28 gg potrebbe essere dovuto all’adattamento verso ripetuti interventi immunizzanti. Il peso era maggiore e la conversione minore nel gruppo inoculato con 4 dosi e 6 dosi, rispetto al controllo, il che suggerisce l’esistenza di una crescita compensatoria a 21-42 gg.
Leeson ha rilevato che soggetti che hanno sofferto restrizioni alimentari precoci sono in grado di esprimere un consumo energetico o un peso corporeo uguale o maggiore a fine ciclo. Ciò può essere spiegato con un adattamento metabolico e un miglioramento del tratto digerente. Inoltre, il trattamento con 8 dosi non ha diminuito la conversione, il che indica che il vaccino va usato a livelli appropriati.
È chiaro che l’insulina è l’ormone chiave, che regola i peptidi e il metabolismo dei carboidrati e dei lipidi nel pollo. L’insulina induce la distribuzione di glucosio nei tessuti adiposi e nel muscolo e previene anche la produzione di glucosio nel fegato. In questa prova non si è notata una variazione significativa di insulina e corticosterone plasmatici, a seguito della seconda iniezione. Queste alterazioni degli ormoni plasmatici sono in grado di spiegare i risultati di crescita sopra descritti. La resistenza all’insulina è uno degli indicatori di stress cronico. Comunque, una concentrazione plasmatica di insulina inferiore nei soggetti trattati NDV è stata rilevata dopo la prima inoculazione, il che indica che il trattamento NDV aveva indotto uno stress immunitario acuto. Al contempo, la concentrazione di corticosterone plasmatico ritornava a livelli normali dopo la seconda iniezione. Gli effetti dello stress sul metabolismo sono stati studiati estensivamente ed è condiviso che lo stress causi uno spostamento dall’anabolismo verso il catabolismo, aumenti la lipolisi e il catabolismo proteico.
In questa prova, non si è vista alcuna variazione significativa di glucosio ematico, proteine totali, colesterolo, trigliceridi e acidi grassi non esterificati. Ciò potrebbe essere dovuto al momento del campionamento o alla dose di inoculazione. Una tempistica di campionamento più dinamica sarà forse necessaria in futuri studi.
Un parametro immunitario importante – il rapporto tra eterofili e linfociti circolanti – è uno dei sintomi più facili da riconoscere dello stress nel pollo. Soggetti trattati con corticosterone hanno mostrato numeri minori di linfociti circolanti. Nello studio presente, il rapporto eterofili/linfociti era leggermente elevato, nei soggetti trattati NDV, a seguito della seconda immunizzazione a 28 gg. Nonostante questo aumento non fosse rilevante, suggerisce che inoculazioni ripetute di NDV possano risultare in una certa immunosoppressione.
Il titolo di anticorpi e la proliferazione linfocitaria corrispondono rispettivamente all’immunità cellulare e umorale. Le conseguenze sull’immunità vengono influenzate dal tipo di immunità (immunoprotettiva, immunoregolatoria, inibitoria o immunopatologica) e dalla durata e dalle misurazioni eseguite sul sistema immunitario. In questa prova i titoli immunitari verso NDV erano notevolmente aumentati a 10 gg dalla prima immunizzazione, e a 5, 9 e 13 dopo la seconda, il che indica che il sistema umorale immunitario era rafforzato da ripetute inoculazioni di NDV.
La riesposizione verso i patogeni spesso ha come risultato una risposta più rapida ed efficace, rispetto a quella che si osserva nella prima vaccinazione, per l’intervento della memoria immunitaria. Non si notavano differenze significative nella risposta linfocitaria alla Concavallina A od PLS nel pollo, tra il controllo e i vaccinati NDV a 28 gg.
Gli autori ipotizzano dunque che la vaccinazione NDV migliori la funzione e i numeri delle cellule T helper circolanti, e di conseguenza venga modulata la produzione di citochine, che attivano le cellule B. I polli stressati mostrano tipicamente una riduzione dello sviluppo muscolare e un aumento del grasso addominale: in questa prova, la composizione delle carcasse e l’utilizzo dei nutrienti non differivano tra i trattamenti, il che indica che l’immunizzazione da NDV non può alterare la composizione corporea.
Conclusioni
La vaccinazione NDV ha ridotto le performance del pollo solo nel periodo immediatamente successivo alla prima vaccinazione, e anzi, un livello appropriato di dosi (4 e 6) ha avuto un effetto benefico sulla conversione e sulla crescita. Il titolo di anticorpi NDV aumentava 10 gg dopo la prima inoculazione e 5, 9 e 13 giorni dopo la seconda. Queste evidenze suggeriscono che un livello appropriato di dosi vaccinali NDV aumenti la conversione nel pollo.
