È stata registrata una nuova tecnica CRISPR che consente di rimuovere in modo selettivo i batteri patogeni, inducendone un’auto-distruzione. Tale tecnica, progettata per rimuovere le sierovarianti di Salmonella e introdotta tramite un vettore Escherichia Coli come probiotico, è stata testata su polli infettati da S. Enteritidis a 5 giorni di età. Si sono formati 3 gruppi, ciascuno di 45 pulcini Ross 308, di cui un gruppo come Controllo e gli altri sottoposti tramite acqua di bevanda a vettore probiotico E. coli da solo o con plasmide anti-Salmonella (Guided Biotics™). I campioni cecali (15 per gruppo) sono stati prelevati al giorno 12 (7 giorni dopo l’introduzione di 3 soggetti eliminatori di salmonella per gruppo) per valutare le cariche di Salmonella (sia dirette che amplificate, con pre-arricchimento) e il peso vivo dei pulcini a 42 gg. Tutti i 30 soggetti testati, nel gruppo sia di controllo che col solo vettore, erano positivi a Salmonella a 12 giorni, col metodo amplificato, con cariche cecali di 500-4.000.000 CFU/g, mentre 22 erano positivi con la metodica normale, non amplificata. L’inclusione del vettore + plasmide nell’acqua di bevanda risultava in zero rilevamenti di Salmonella nei soggetti con la conta diretta, mentre 8 su 15 erano negativi con la conta amplificata. Questa combinazione, inoltre , riduceva la media di salmonelle, approssimativamente di 3 logaritmi. I soggetti nel gruppo vettore + plasmide erano il 15% più pesanti dei gruppi controllo e col solo vettore. Questa prova ha stabilito la capacità di questa tecnica di rimuovere selettivamente batteri specifici dall’intestino dei polli.
Introduzione
Negli ultimi decenni le filiere di carne, uova e latte hanno dovuto ridurre l’uso routinario di antibiotici nelle produzioni animali e si sono ritrovati a che fare con un’elevata incidenza di tossinfezioni alimentari associata al consumo di prodotti animali. Nel 2013 sono state usate circa 130.000 tonnellate di antibiotico a livello globale, di cui il 75% negli animali. Circa il 90% degli antibiotici viene escreto nell’ambiente tramite urine e feci, e nei batteri cecali del pollo possono essere rilevati fino a 400 markers di resistenza, verso 25 antibiotici diversi. Globalmente, circa 700.000 persone muoiono a causa della resistenza agli antibiotici e tale dato è in aumento: la FAO prevede che salga a 10 milioni nel 2050. Con questi problemi di resistenza antibiotica per la salute umana, legislatori, consumatori e venditori hanno deciso di ridurne l’uso sub-terapeutico negli animali e nei mangimi, fino ad azzerarlo. Il riemergere di malattie endemiche, però, con costi aggiuntivi per la produzione animale, costringe però a cercare alternative all’uso di antibiotici.
Le tossinfezioni alimentari continuano a essere un problema nel mondo, con i casi di salmonellosi in aumento in molti Paesi. Le salmonellosi non tifoidee sono la causa di un milione di infezioni, 19.000 ospedalizzazioni e circa 400 morti all’anno in USA, con alcune sierovarianti di salmonella negli alimenti che mostrano resistenza antibiotica. Anche se l’incidenza della salmonellosi è tradizionalmente abbastanza bassa in Australia, di recente anche in questo Paese si sono visti episodi associati alle uova, che hanno richiamato l’attenzione delle autorità e dei consumatori.
Oggi è possibile che un batterio target si autodistrugga, grazie all’uso del CRISPR, la sequenza biologica che lo rende evidente al sistema immunitario. Tale tecnica è estremamente precisa, tanto che coinvolge solamente un batterio o una gamma di batteri specifici. Ciò significa che, a differenza di molti antibiotici, la tecnica può essere usata per rimuovere solo i batteri non desiderati dal microbioma intestinale degli animali, lasciando attiva la flora benefica, che, immodificata, migliora il benessere e le prestazioni dei polli. Un modo per indurre l’autodistruzione dei batteri nell’intestino animale è introdurre dei plasmidi nell’organismo target, inclusi probiotici nel mangime o nell’acqua. Questa prova sottolinea la capacità di questa tecnica della Guided Biotics™ di ridurre la colonizzazione da parte della Salmonella nei polli infettati.
Metodo
Nella prova è stato usato come vettore un ceppo apatogeno di E. Coli, a cui è stato aggiunto un plasmide che includeva una sequenza CAS e 3 sequenze specifiche target per tutte le sierovarianti di Salmonella. 165 pulcini Ross 308 di un giorno, sono stati accasati in condizioni di biosicurezza, con acqua, mangime e condizioni standard di allevamento. I polli sono stati inoculati ogni giorno dal giorno 1 in questo modo:
1) nessuna aggiunta all’acqua (45 pulcini)
2) vettore E. Coli immodificati a 108 CFU nell’acqua (45 pulcini)
3) Guided Biotics™ anti Salmonella a 108 CFU in acqua (45 pulcini).
In parallelo, a un gruppo di 30 soggetti al giorno 1 è stato somministrato oralmente 0,5 ml 105 CFU/ml di Salmonella Enteritidis ceppo FS26. I soggetti controllati per la colonizzazione da Salmonella sono stati sottoposti, al giorno 3, a tampone cloacale. Al giorno 5, 3 soggetti, identificati come colonizzati da Salmonella (105 CFU nei tamponi) sono stati aggiunti a ciascuno dei gruppi in esame. 15 polli non eliminatori, da ciascun gruppo, sono stati quindi soppressi al giorno 12 (7 giorni dopo essere stati mescolati con gli eliminatori di Salmonella) e si è esaminato il contenuto cecale di Salmonella, con metodi diretti e amplificati. I campioni cecali sono stati diluiti serialmente in PBS prima della messa in piastra in XLD agar per la conta diretta, mentre quelli per la conta amplificata sono stati incubati prima in brodo selenite cistina, per 18 ore a 41 °C , prima della messa in piastra e successiva conta. Per la trasformazione dei dati, i campioni negativi in entrambi i metodi sono stati allocati come conta a 1 CFU/g. I pesi dei polli rimasti sono stati monitorati al giorno 42. Cariche e pesi sono stati trasformati in logaritmo e sottoposti ad analisi statistica tramite GraphPad prism. I dati delle cariche batteriche sono stati stabilizzati per la distribuzione normale, usando il test D’Agostino e Pearson e quelli degli animali tramite il test Kruskall-Wallis, con successivo confronto Dunn di comparazione. Le differenze sono poi state analizzate col test Fisher.
Risultati
Tutti in polli del gruppo eliminatore di salmonella hanno evidenziato cariche cloacali di Salmonella di oltre 105 CFU/g al giorno 3. Il giorno 12 (7 giorni dopo l’introduzione dei soggetti eliminatori nei gruppi in prova), tutti i polli del controllo e del vettori E. Coli erano positivi, alla conta con l’arricchimento, e mostravano cariche cecali di 500-4.000.000 CFU/g (Tabella 1). Di questi 30 soggetti, 22 erano parimenti positivi alla conta diretta senza arricchimento. Comunque, quando si aggiungeva il Guided Biotics™ anti Salmonella all’acqua di bevanda, non si trovava Salmonella in nessuno dei soggetti sottoposti a metodo diretto, e solamente in 8 su 15 con l’arricchimento. Il trattamento Guided Biotics™ quindi riduceva le media del U/g a 18 CFU/g e inoltre migliorava il peso vivo a 42 gg del 15% (Figura 1).
Discussione
Il metodo di infezione sperimentale usato in questa prova è in linea con quello che spesso si usa nei test per i vaccini di Salmonella e può essere considerato valido. Tutti i polli infetti ed eliminatori sono stati introdotti nei gruppi e la Salmonella trasmessa ai soggetti messi a contatto si confermava essere un ceppo altamente infettante. Ciò era confermato dall’elevata carica infettante cecale in tutti i polli di controllo, 7 giorni dopo l’introduzione degli infetti. Al contrario, Guided Biotics™, somministrato nel tratto digerente, riusciva a fermare la colonizzazione della Salmonella in 8 su 15 (ovvero il 53%) dei polli in esame. La media delle conte di Salmonella nei digesta cecali risultava ugualmente ridotta di circa 3 log e il massimo della diminuzione della carica di Salmonella era da 4 milioni CFU nei soggetti di controllo a 500 CFU in quelli sottoposti a Guided Biotics™. Inoltre il 15% di aumento del peso vivo nei polli trattati, rispetto al gruppo di controllo, indica ulteriormente la gravità dell’infezione da Salmonella usata in questa prova. L’assenza di qualsiasi effetto del vettore E. Coli sulla colonizzazione conferma che il plasmide era fondamentale per la riduzione della Salmonella.
Questa prova valuta la capacità di Guided Biotics™ di rimuovere specificamente batteri indesiderati, in questo caso una singola sierovariante di Salmonella. La tecnologia è progettata per colpire circa 2.400 sierovarianti di Salmonella e test di laboratorio ne hanno stabilito l’efficacia verso le principali sierovarianti pericolose per le tossinfezioni alimentari umane.
Test di laboratorio in corso hanno anche indicato che queste tecniche sono applicabili verso batteri indesiderati come Clostridium perfringens e patogeni aviari come E. Coli. Inoltre, poiché la progettazione del target è specifica, i test hanno confermato che l’annientamento di batteri diversi da quelli target può essere evitato preservando i commensali apatogeni. È chiaro dunque che Guided Biotics™ rappresenta una tecnologia capace sostituire in parte gli antibiotici, nella produzione avicola, riducendo le zoonosi e mantenendo le rese dei polli antibiotic-free.
