Valutazione fenotipica dell’antibiotico-resistenza in ceppi di E. coli

Laura Musa 1, Patrizia Casagrande Proietti 1, Tana Shtylla Kika 2, Sara Bellucci 1, Raffaella Branciari 1, Laura Menchetti 1, Rossana Roila 1, Alberto Giannone 1, Maria Pia Franciosini 1 - 1 Dipartimento di Medicina Veterinaria, Università degli Studi di Perugia, Via S. Costanzo, 4, 06126 Perugia PG - 2 Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria, Facoltà di Medicina Veterinaria, Università Agricola di Tirana

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E. coli è sicuramente reputata tra le specie batteriche in cui più rapidamente si è verificata la selezione di geni di resistenza a seguito dell’uso di antimicrobici (Tadesse et al., 2012). Questo microrganismo, a causa della sua elevata diffusione, è considerato anche un indicatore dell’antibiotico-resistenza delle popolazioni di gram negativi e un modello per lo studio di AMR (Kaesbohrer et al., 2012). Di particolare interesse è il riscontro di isolati di E. colimultiresistenti e ESBL di cui le specie avicole, in particolare pollo e tacchino, sono considerate un’importante fonte di contaminazione per l’uomo (De Been et al., 2014; Falgenhauer et al., 2019). L’uso indiscriminato di antibiotici nel settore avicolo ha contribuito infatti a creare l’aumento progressivo di E.coli resistenti alla maggiori classi di antibiotici quali chinoloni, tetracicline e beta lattamici (Van den Bogaard et al., 2000; Hricovà et al., 2017). I geni responsabili della resistenza sono, inoltre, frequentemente localizzati a carico di elementi genetici trasferibili come plasmidi; pertanto E. coli può facilmente ricevere e trasmettere geni di resistenza antimicrobica ad altri batteri del microbiota intestinale tramite coniugazione (Carattoli et al., 2008; Bailey et al., 2010; Laxminarayan et al., 2013). In risposta a questa problematica le grandi aziende si sono indirizzate alla produzione avicola tramite management biologico o antibiotic-free, nel quale il ricorso al farmaco è previsto solo in condizioni di necessità. L’obiettivo di questo lavoro è stato pertanto valutare in tali tipologie di allevamento, comuni nel centro Italia, la diffusione di ceppi di E. coli antibiotico-resistenti in rapporto a una diversa natura dei prelievi effettuati in momenti differenti della catena di produzione del broiler (allevamento e mattatoio).

Materiali e metodi

Campionamento

I campionamenti sono stati effettuati in gruppi di polli da carne (Ross 308) di consistenza numerica pari a 4.600/5.000 capi, allevati con sistema biologico e antibiotic-free. In questo ultimo caso i soggetti sono stati allevati in ambiente condizionato, seguendo il management dell’allevamento convenzionale (piani di vaccinazione, alimentazione) tranne che per l’uso di antimicrobici, a cui si è ricorso solo in caso di necessità. I prelievi, consistenti in tamponi cloacali e campioni ambientali (mangiatoie, abbeveratoio, lettiera), sono stati raccolti in allevamento a T1 (immissione) e a T2 (a 30 gg). Al macello (T3) sono stati prelevati individualmente dalle carcasse il contenuto cecale e la pelle del collo, quindi i campioni sono stati mantenuti a temperature di refrigerazione di 4 °C fino all’arrivo in laboratorio.

Isolamento e identificazione di E. coli

Per l’isolamento di E. coli i campioni posti in terreno di pre-arricchimento costituito da acqua peptonata tamponata (BPW) in rapporto 1:10 sono stati incubati a 37 °C per 18-24 ore in aerobiosi. Da ciascun campione, così diluito, è stata prelevato lo 0,1 ml di soluzione e quindi seminato su agar Mac Conkey, incubato per 24 h a 37 °C in anaerobiosi. Le colonie con una morfologia tipica, riferibile a E. coli, sono state confermate mediante appropriate prove biochimiche. Per l’identificazione di ceppi ESBL, gli isolati sono stati seminati su agar Mac Conkey, addizionato con basse concentrazioni (1mg/L) di cefotaxima, messo a incubare a 37 ± 1 °C per 18-24 h in condizioni di aerobiosi. I ceppi cresciuti sono stati testati per la conferma della produzione di ESBL mediante il test di combinazione con cefpodoxima, da solo e associato con acido clavulanico (Thermo Fisher Scientific, Rodano, MI).

Test di suscettibilità agli antibiotici

Per valutare la suscettibilità agli antimicrobici è stato utilizzato il test di diffusione su agar contenente diversi antibiotici a determinate concentrazioni: ampicillina (AMP) (10μg), cefotaxima (CTX) (30μg), ceftazidima (CAZ) (30μg), amoxicillina+acido clavulanico (AMC) (30μg), acido nalidixico (NA) (30μg), ciprofloxacina (CIP) (5μg), trimetoprim/sulfametoxazolo (SXT) (25μg), (TE) tetraciclina (30μg), gentamicina (CN) (10μg). Le piastre sono state incubate a 37 °C per 24 ore in condizioni di aerobiosi. I risultati sono stati valutati secondo le linee guida di CLSI (Clinical and Laboratory Standards Istitute).

Analisi statistiche: le proporzioni relative di campioni resistenti, intermedi e sensibili sono state messe a confronto utilizzando i test chi-quadro o Fisher. Le proporzioni di colonna sono state confrontate con il test z utilizzando la correzione di Bonferroni. Per valutare l’effetto del tempo, del tipo di allevamento e del tipo di matrice sul numero di resistenze è stato utilizzato un modello di regressione logistica ordinale. I risultati sono stati poi espressi come odds ratio (OR) con i corrispondenti intervalli di confidenza (CI) al 95% e P-value. Un valore di P<0,05 è stato considerato significativo. Le analisi sono state realizzate utilizzando il software per le analisi statistiche SPSS versione 25.0 (IBM Inc., Chicago, IL, USA).

Risultati

Indipendentemente dalle caratteristiche di allevamento, dal tipo e dal tempo di campionamento, è stato riscontrato un elevato numero di E. coli resistenti nei confronti di TE (85,6%), AMP (66,4%) e NA (60%) (Figura 1). Esaminando inoltre i pattern di resistenza si osserva che il 24,8%, il 23,2%, 26,4% e 8% di E. coli mostrano rispettivamente resistenza nei confronti di 2, 3,4 e 5 antibiotici (Tabella 1). Paragonando la suscettibilità degli isolati in relazione alla tipologia di allevamento risulta che un maggior numero di E. coli resistenti a AMC è stato isolato negli allevamenti antibiotic-free rispetto a quelli biologici (25.4% vs 6.1%, P<0,001) (Tabella 2). In relazione ai tempi di campionamento si evidenzia una diminuzione nel riscontro degli isolati resistenti di E. coli da T1 a T3 nei confronti di AMP (dal 77% al 47%, P=0,002), CAZ (dal 31% al 2% , P<0,001), CTX (dal 67% al 10% P<0,001) e AMC (dal 36% al 4%, P <0,001), TE (95% al 71%, P<0,001) (Tabella 3).

Va sottolineato che solo nel caso di NA e SXT, pur verificandosi una diminuzione di ceppi resistenti alla macellazione (41% e 24% rispettivamente) se paragonato a quelli presenti in T1 (62% e 31% rispettivamente), si osserva un aumento dei ceppi resistenti in T2 (86% e 71% rispettivamente – Tabella 3). Per quanto riguarda la tipologia del campione, in linea generale, i tamponi cloacali e ambientali hanno presentato il più alto numero di E. coli resistenti nei confronti di AMP, CTX, AMC, NA, SXT e TE se paragonati ai prelievi effettuati in sede di macellazione (Tabella 4). Nel caso di CIP il numero di E. coli resistenti a livello a cutaneo riscontrati alla macellazione è stato più alto di quello riferito al contenuto intestinale (37,5% vs 4,5%, P<0,001 – Tabella 4). In totale sono stati isolati 6 ceppi di E. coli ESBL, 4 dall’allevamento biologico e 2 da quelli antibiotic-free, di questi solo 1 è stato isolato alla macellazione a livello di contenuto cecale proveniente da pollo biologico.

Discussione

Il nostro studio ha messo in evidenza la presenza di un numero elevato di ceppi resistenti a TE e AMP indipendentemente dalla tipologia di allevamento, dalla natura e dal momento del prelievo; un dato non del tutto sorprendente in relazione al fatto che questi antibiotici sono da tempo utilizzati in campo avicolo (Yassin et al., 2017). Dall’analisi dei pattern di resistenza risultano diffusi i ceppi caratterizzati da multi-resistenza in conformità a quanto riportato da altri autori (Dandachi et al., 2018; Davis et al., 2018). Nel nostro lavoro sono stati riscontrati più frequentemente ceppi di E .coli con resistenza multipla nei confronti di beta lattamici, ciprofloxacina, tetraciclina e sulfametoxazolo associato a trimetoprim. Negli allevamenti antibiotic-free è stato evidenziato, in paragone agli allevamenti biologici, un numero significativamente più elevato di E. coli resistenti a amoxicillina e acido clavulanico, associazione utilizzata da tempo in medicina umana (Finlay et al., 2003). Va ricordato che fluorochinoloni, macrolidi e beta lattamici seppure ammessi per l’uso in campo zootecnico, sono considerati da OMS (Organizzazione Mondiale della Sanità, 2016) tra gli antibiotici più “critici” per il realizzarsi di fenomeni di   antibiotico-resistenza negli umani. In relazione alla tempistica dei prelievi, indipendentemente dalla tipologia, viene rilevata una diminuzione dei ceppi resistenti nei confronti della maggior parte degli antibiotici testati, quasi a sottolineare una possibile “clearance”, favorita dall’assenza di trattamenti antimicrobici, che si attua a carico di una popolazione di E. coli, costituita perlopiù da ceppi resistenti, presente fin dalla alla nascita e ereditata dai riproduttori. Nilsson et al. (2014) hanno riportato il frequente riscontro nei grandparents del gene blaCMY2 e del clone di E. coli carrier di blaCMY-2, a tutti i livelli della produzione piramidale caratterizzante il settore avicolo. Se consideriamo il grado di contaminazione in relazione alla natura dei campioni, i prelievi ambientali e i tamponi cloacali presentano un alto numero di ceppi resistenti, specialmente nei confronti delle tetracicline. Questa classe di antibiotici è forse la più “datata” in termini di uso in zootecnia e, nonostante l’avvento di nuove molecole, viene ancora impiegata in particolare la doxiciclina per il trattamento di forme respiratorie di natura batterica, spesso in alternativa ai chinoloni in virtù degli elevati livelli di resistenza registrati nei confronti di questi ultimi (Endtz et al., 1991; Hricová et al., 2017).

Alla macellazione si registra, in linea generale, una riduzione dei ceppi di E. coli resistenti dovuta verosimilmente nel caso di campioni cutanei al transito nel tunnel di refrigerazione che sicuramente può influenzare la carica batterica di superficie. Interessante è il risultato relativo al basso numero di E.coli resistenti riscontrato a carico dei campioni di contenuto cecale che supporta il riscontro della diminuzione dei ceppi resistenti osservato nei prelievi effettuati in tempi successivi durante il ciclo di allevamento. Nell’ambito della popolazione di E.coli resistenti, solo 6 sono risultati ESBL, di cui 4 provenienti dall’allevamento biologico e verosimilmente acquisiti dall’ambiente esterno.

Conclusioni

I dati preliminari, pur confermando l’esistenza di una problematica che attualmente è definita un’emergenza per la salute pubblica, risultano incoraggianti soprattutto quelli riferiti a una diminuzione dei ceppi resistenti di E. coli in prelievi realizzati lungo il ciclo di produzione e alla macellazione. Ciò potrebbe essere giustificato dall’applicazione di protocolli aziendali in cui il ricorso all’antibiotico è assente (allevamento biologico) o è previsto solo in caso di effettiva necessità (allevamento antibiotic-free) e al rispetto di norme igieniche alla macellazione che hanno limitato eventuali fenomeni di contaminazione crociata tra le carcasse. Viene comunque sottolineata l’importanza di un controllo indirizzato a valutare la suscettibilità agli antibiotici del microbiota dei Grand Parents che si configurano tra i maggiori responsabili del fenomeno di antibiotico-resistenza nella catena di produzione avicola, come supportato dall’alto numero di E. coli resistenti nei tamponi cloacali isolati a 1 giorno di vita nel nostro lavoro.

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