Evoluzione della malattia di Newcastle a bassa virulenza

Patti J. Miller , Southeast Poultry Research Laboratory , Athens, GA , U.S.A.

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Non tutti i virus della malattia di Newcastle causano la malattia di Newcastle (ND). Solo un’infezione da NDV, definita come virulenta, provoca questa patologia. Non tutte le infezioni da NDV sono virulente: per esempio, quelle che derivano dall’uso dei vaccini negli Stati Uniti spesso non danno luogo ad episodi rilevanti.

L’Organizzazione Mondiale per la Salute Animale (OIE) è responsabile per la definizione degli NDV al fine di regolamentare gli scambi di avicoli e dei loro derivati a livello internazionale.

L’OIE definisce la malattia Newcastle come un’infezione causata da un virus altamente virulento APMV-1che ha le seguenti caratteristiche: 1) ha un indice di patogenicità intracerebrale (IPIC) di almeno 0,7 o superiore nei pulcini di un giorno; 2) una sequenza di aminoacidi basici multipli nel virus (sia direttamente che tramite deduzione), nella parte terminale C della proteina F2, e della fenilalanina, al residuo 117, che è N terminale della proteina F1.

Il termine “aminoacidi basici multipli” si riferisce ad almeno 3 arginine o lisine residue, poste tra i pezzi 113 e 116. Se non si dimostra l’andamento caratteristico dei residui aminoacidici, come sopra descritto, sarà allora necessaria la caratterizzazione del virus isolato ed un test IPIC. In questa definizione i residui aminoacidici sono numerati sul terminale N della sequenza aminoacidica della proteina F, dedotta dalla sequenza nucleotidica del gene F0: 113-116 corrispondente ai residui -4 a -1 da sito di clivaggio. Il sito di clivaggio è posto tra la posizione 116 e 117. Le proteasi che scindono questo sito possono essere sia intra- che extracellulari. Solitamente, le proteasi dell’ospite separano le proteine di fusione, ma anche i batteri possono avere questo ruolo.

Il virus della malattia di Newcastle virulento (vNDV) viene scisso da proteasi che si trovano in tutto l’ospite, e ciò consente al virus di essere rinvenuto a livello sistemico ed in molti organi. NDV di bassa virulenza invece, visto che non ha aminoacidi basici multipli, viene separato solo dalle proteasi limitate al tratto gastrointestinale e respiratorio. La proteina emoagglutininaneuraminidasi (HN) e quella di fusione (F) sono glicoproteine che vengono esposte alla superficie esterna delle particelle di NDV, e gli anticorpi nei loro confronti sono quelli in grado di neutralizzare il virus.

Prima che la sequenziazione del genoma fosse disponibile, i virus della malattia di Newcastle erano classificati con terminologie che si riferivano alle forme cliniche che causavano nel pollo. In ordine di virulenza crescente erano descritti come: asintomatico, enterico (Ulster), lentogeno (La Sota), mesogeno (Roakin) o velogeno (California/ 2002).

Spesso i NDV velogeni sono ulteriormente suddivisi in neurotropici o viscerotropici, sulla base delle forme cliniche che causano. NDV neurotropico causa sintomi neurologici (torcicollo, paralisi degli arti o delle ali), mentre il viscerotropico causa lesioni, sia anatomo- che istopatologiche (emorragie e necrosi) insieme a leggeri sintomi nervosi.

Con la sequenziazione del genoma, oggigiorno facilmente disponibile, la maggior parte degli NDV vengono adesso classificati sia come virulenti (vNDV), che poco virulenti (loNDV).

Un’altra possibilità di valutare le sequenze del genoma degli NDV che vengono isolati è quella di paragonare i loro genomi usando programmi di computer in grado di discernere quanto siano simili o correlati tra loro, e con i propri gruppi, ai rispettivi alberi filogenetici. Il nome completo del virus (specie, numero dell’isolato, luogo di isolamento ed anno di isolamento) dimostra come essi cambino, nel tempo e nelle diverse località..

Gli NDV sono descritti come appartenenti a linee o genotipi che non sono intercambiabili tra loro (la linea 5 non è infatti uguale al genotipo 5). Qui viene impiegato il termine genotipo. I genotipi possono essere raggruppati in due classi, la I e la II. Le anatre solitamente trasportano NDV classe I, ma non è raro isolare da esse anche virus di classe II. Tutti gli NDV di classe I sono a bassa virulenza, tranne un NDV che è stato isolato in Irlanda nel 1990.

La classe II contiene i virus a bassa virulenza (La Sota, B1, VG/VA) ed i vNDV, che vengo suddivisi, a loro volta, in 16 genotipi, alcuni dei quali hanno degli ulteriori subgenotipi.

Secondo la classificazione di Diel, gli NDV di ogni genotipo hanno differenze di nucleotidi superiori al 10%. Mentre esiste una prova sperimentale di una reale diminuzione di escrezione di virus nei soggetti vaccinati, quando si usa un ceppo dello stesso sierotipo vaccinale e genetico anche se si tratta di virus non geneticamente correlati, nei soggetti sani, se vengono vaccinati, si otterrà il 90% di protezione dalla morbilità e mortalità, sempre che ci sia abbastanza tempo perché si sviluppi un’appropriata risposta anticorpale.

Differenze di specie

Come è stato qualche volta detto – “i tacchini non sono grandi polli” – occorre tener ben presente che gli isolati NDV non infettano tutte le specie avicole, e non allo stesso modo. Storicamente, la maggior parte delle specie avicole sensibili alla Malattia di Newcastle, in ordine decrescente, sono i polli, tacchini, le oche e le anatre. Comunque, alcuni NDV crescono meglio se sono adattati a specie particolari. Esiste una grande variabilità nella malattia clinica in infezioni dei polli con diversi isolati di NDV da piccione, spesso descritti come PPMV-1.

I vNDV di alcuni cormorani crescono meno velocemente in embrione di pollo, ed arrivano a titoli inferiori rispetto a quanto osserviamo tipicamente negli NDV isolati dal pollo. Tuttavia, è noto che dal 1992 le specie avicole (tacchini all’aperto) possono essere infettate da NDV derivanti dai cormorani. Nonostante sia necessaria una dose maggiore di NDV per infettare una specie alla quale il virus non sia adattato, una volta che lo ha fatto, dosi minime di virus sono in grado di contagiare anche altre specie.

Nel Minnesota (USA) il virus della malattia di Newcastle è presente nei tacchini dal 2008

Nel 2008 e 2009 furono inviati dei campioni ai laboratori NVSL provenienti da alcuni gruppi di tacchini del Minnesota, che avevano sintomi respiratori. I tipici test di caratterizzazione, fatti su 8 isolati di NDV, rivelarono un IPIC non virulento (inferiore a 0,7) nei pulcini ed un’insolita fusione nel sito di clivaggio 113K-Q-G-R-F117. C’era malattia respiratoria nel gruppo, ma furono isolati anche altri agenti batterici e virali, confondendo così il quadro clinico. Solo pochi degli altri NDV noti mostravano la stessa sequenza ed erano ceppi isolati da soggetti provenienti da mercati avicoli statunitensi e da oche in Italia nel 2010.

Furono attuate ulteriori caratterizzazioni di questo ceppo turkey/US/(MN)/604/2009. Sperimentalmente, l’infezione naturale (virus somministrato in occhio e naso) con questo ceppo non produceva alcun sintomo clinico. Aveva un IPIC di 0,00 nei pulcini SPF, e causava occhi acquosi, starnuto, ingrossamento dei seni ed un IPIC da 0,19 a 0,38 nei tacchini SPF. Il campione inoculato risultava negativo per batteri e per Metapneumovirus aviari. Come riferimento, il ceppo vaccinale La Sota ha un IPIC da 0,19 a 0,4 nei pulcini di 1 giorno, ma da 0,1 a 0,19 nei tacchinotti. La dose letale media embrionale (ELD50), per i polli era maggiore (107) della quota necessaria per uccidere un embrione di tacchino (106). Comunque, il virus cresceva a titoli (EID50) di 108,9 nelle uova di pollo embrionate (ECE), ma raggiungeva titoli di 109,3 nelle uova di tacchino embrionate (ETE). Per calcolare il tempo medio di mortalità (MDT) 1 ml di ciascuna diluizione era inoculato nella cavità allantoidea di 5 embrioni SPF di 9-11 giorni, facendo poi la speratura ogni 2 giorni per una settimana. I giorni in cui gli embrioni morivano erano annotati, così come il tempo medio in ore della diluizione maggiore (ovvero quella con meno virus) che riusciva ancora ad uccidere tutti e 5 gli embrioni. Il MDT per ECE è stato di 109 ore (diluizione -5) e di 127 per ETE (diluizione -8): una quota inferiore di virus era quindi in grado di uccidere le uova di tacchino. La diluizione -5 che uccideva le uova ETE lo faceva in 105 ore. Mentre il virus sembra essere più adattato alle uova di tacchino e leggermente meno virulento nelle uova di tacchino e nei tacchinotti, gli indici di patogenicità nei tacchini (MDT e IPIC) rientravano comunque nei parametri dei virus lentogeni NDV. I polli smettono di diffondere il virus 9 giorni dopo l’infezione, mentre c’è una qualche evidenza che i tacchini lo eliminino dalla tonsille cecali, per periodi più lunghi. La durata dell’eliminazione del virus può dipendere da fattori multipli, come lo stato immune del soggetto e come si sia adattato alle varie specie il NDV.

Il timore di avere dei virus NDV con due aminoacidi basici ed una fenilalanina nel punto di fusione del clivaggio deriva dagli episodi del 1998 in Australia. Dopo il 1998, i tamponi raccolti mesi prima della malattia furono caratterizzati e si identificarono i progenitori, che risultarono essere ceppi di virulenza intermedia. La teoria è quindi che ceppi di NDV a bassa virulenza circolassero da mesi nella popolazione di polli (e di altri volatili, probabilmente), e che fossero poi avvenute delle mutazioni che aumentavano il numero di aminoacidi basici. L’unica altra ipotesi collegabile a tale evento, è l’isolamento di virus di classe I NDV (Irlanda 1990), che era antigenicamente il più simile all’NDV di bassa virulenza della fauna acquatica residente nella stessa area.

Considerazioni finali

Quando si discute la predisposizione di specie ai virus della malattia di Newcastle, vanno considerati anche i ceppi di NDV, dal momento che alcuni si sono meglio adattati a crescere in una certa specie rispetto ad altri. A livello sperimentale, non è stato riscontrato alcun ceppo di vNDV, iniettato sperimentalmente, capace di compromettere una popolazione con una copertura del 90% derivante dalla vaccinazione LaSota, sia come forma clinica che come mortalità.

I polli vaccinati, anche se hanno alti livelli anticorpali, come le galline, possono però venire infettati da vNDV, ma spesso gli unici sintomi clinici osservabili sono una riduzione nella produzione di uova oppure uova dal guscio deformato, per un periodo di circa 30 giorni dopo l’infezione. I soggetti vaccinati eliminano i virus nell’area. Sperimentalmente, la quota di vNDV eliminata dai polli in ambiente può essere diminuita quando si correla il genoma del vaccino, sia vivo che spento, a quello del virus di campo. Gli isolati 2008 e 2009 dai tacchini erano di bassa virulenza, ma avevano siti di fusione del clivaggio unici, che sono solamente lontani di un nucleotide rispetto ai ceppi virulenti vNDV di riferimento.