Valutazione con tecnica metagenomica del microbiota intesti-nale in polli da carne trattati con il prebiotico Algatan®

A.Scolari -Laboratorio Vallerana Srl. – Cremona (Italia) - alessandro.scolari@vallerana.com / Pedro González-Torres - Microomics Systems S.l. – Barcelona

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Lo studio del microbiota intestinale è diventato sempre più importante negli ultimi anni poiché si identificano sempre più frequentemente correlazioni tra la sua composizione e la comparsa di patologie di varia natura, tanto nell’uomo come in diverse specie animali.

In avicoltura, la recente forte riduzione dell’uso di antibiotici ha costretto i produttori a prendere in considerazione l’utilizzo di strategie alternative per mantenere la salute e l’integrità intestinale dei polli da carne. Per questo motivo, è importante aumentare le conoscenze sul microbiota intestinale dei polli e sulla possibilità di modularlo attraverso la dieta, sia con l’uso di diverse tipologie di additivi che con modifiche nella razione alimentare.

Introduzione
Utilizzando la metagenomica è possibile esaminare e conoscere tutta la diversità microbica presente in campioni provenienti da diversi ambienti direttamente, attraverso una singola operazione analitica e senza la necessità di colture tradizionali. Questa tecnica si basa sul sequenziamento del gene dell’rRNA 16S (presente nei ribosomi). La metagenomica consente di differenziare i diversi batteri che colonizzano varie sezioni dell’apparato digerente, poiché la sequenza di questo gene è unica in ogni specie, come se si trattasse di un codice a barre. I dati che si ottengono possono essere estremamente utili per l’industria avicola, che si trova in una fase cruciale del suo sviluppo.

Infatti, negli ultimi anni, l’affinamento delle tecniche di prevenzione e di sanificazione, associate all’utilizzo di nuove tecniche produttive, ha permesso di ottenere una forte riduzione dell’uso di prodotti antimicrobici per la crescita dei polli da carne in Italia (-87% di utilizzo nell’anno 2019 in relazione al 2011 – in mg/pv). Uno dei fattori che contribuiscono maggiormente al raggiungimento e/o miglioramento di questo risultato è il mantenimento della salute intestinale degli animali, che può essere ottenuto anche con l’utilizzo di additivi alimentari di varia natura (prebiotici, probiotici, simbiotici, enzimi o acidi organici benefici, tra gli altri).

L’uso della metagenomica consente una valutazione più precisa dei mutamenti che possono essere indotti nel microbiota intestinale dei polli, modificando gli additivi nei mangimi o semplicemente la dieta degli animali.

In questo studio è stato valutato con la metagenomica il microbioma ciecale di polli da carne, alimentati con un prebiotico la cui influenza sulle popolazioni microbiche intestinali era stata verificata solo con le tecniche microbiologiche classiche. Rappresenta quindi un modello strumentale per condurre nuove ricerche sul microbioma, un approccio importante e diretto all’analisi delle possibilità di modulazione dello stesso con la dieta, con l’obiettivo di migliorare la salute intestinale, il benessere e la crescita negli animali, contribuendo a ridurre l’utilizzo di sostanze ad azione antimicrobica.

Materiali e metodi. Descrizione della prova e del campionamento

Per l’esecuzione della prova sono stati utilizzati due capannoni identici, con la stessa gestione, nei quali sono stati allevati polli della stessa età, razza, provenienti dagli stessi allevamenti di riproduttori e incubatoio, alimentati con lo stesso mangime. Nel capannone 1 i polli sono stati alimentati con mangime integrato con l’additivo Algatan® (0,3% fino a 28 giorni di età e 0,2% fino a 50 giorni, alla fine del periodo di allevamento), mentre quelli del capannone 2 sono stati considerati controlli non trattati. A 50 giorni di età, il contenuto ciecale di 60 polli per ciascun gruppo è stato prelevato nel macello, in provette Eppendorf da 1 ml, in pool di 3 individui, per un totale di 20 provette per ogni gruppo di polli. I campioni sono stati immediatamente immersi in ghiaccio secco e successivamente conservati a -80 °C fino all’esecuzione dei test. In entrambi i capannoni non sono stati somministrati antibiotici nel corso del ciclo produttivo.

Caratteristiche del prebiotico Algatan®

È una miscela di estratti di alghe provenienti da diverse parti del mondo, contiene polisaccaridi e polifenoli di origine marina e terrestre. Ha proprietà nutritive, antibatteriche, antiossidanti, immunostimolanti e antinfiammatorie. In particolare, l’attività antibatterica viene monitorata in tutti i lotti “in vitro”, confrontando la crescita di vari batteri in brodo di coltura (BHI) dopo 3 ore di incubazione. La differenza di crescita batterica nelle provette con o senza prodotto aggiunto (alla concentrazione dello 0,5%) è da 2 a 3 Log10 inferiore nelle provette contenenti Algatan® (Grafico 1).

In diverse prove di campo è stata verificata l’attività di Algatan® contro Campylobacter spp. Nel Grafico 2 sono descritti i risultati della conta di questi batteri in tamponi cloacali di polli da carne allevati in 4 capannoni (prelevati a 28, 38 e 51 giorni di età). Il primo e il secondo capannone erano considerati controlli non trattati, il terzo è stato trattato con Algatan® dal primo giorno (da 1-28 gg. allo 0,3%; da 28-51 gg. allo 0,2%), il quarto, a partire da 28 giorni (da 28-38 gg. allo 0,3%; da 38-51 gg. allo 0,2%). La riduzione della conta di Campylobacter spp. è evidente nei due capannoni trattati ed è statisticamente significativa nel terzo capannone (p <0,05).

Risultati e discussione

Attraverso l’analisi della subunità ribosomiale 16S dell’RNA (rRNA16S), abbiamo voluto confermare quanto era già stato visto con le analisi microbiologiche tradizionali e approfondire la nostra conoscenza sulle popolazioni batteriche presenti nei ciechi di polli trattati e non trattati con Algatan®.
In particolare, sono stati identificati tre obiettivi:

1) il calcolo della diversità alfa tra le specie batteriche presenti in ciascun animale trattato e non trattato;
2) il calcolo della diversità beta tra i campioni del gruppo di animali trattati e quello dei non trattati;
3) lo studio dei profili tassonomici dei batteri ciecali, a partire dal livello di phylum fino al livello delle specie, per quantificare la presenza di tipologie correlate alla salute e all’integrità intestinale.

Calcolo della diversità Alfa

Il calcolo: si riferisce alla diversità tra le specie batteriche presenti in ciascun animale. Diversi autori hanno riscontrato una relazione tra l’aumento della diversità batterica nell’intestino dei polli e la diminuzione dell’indice di conversione dei mangimi, la salute e la resilienza intestinale.
Il Grafico 3 rappresenta la diversità Alfa, calcolata con l’Indice di Shannon, che risulta maggiore nei ciechi di animali trattati con Algatan® (a sinistra) rispetto al gruppo di animali non trattati.

Calcolo della diversità Beta

Il calcolo fa riferimento alle differenze nel microbioma confrontando tutti i campioni dei gruppi di animali trattati con quelli non trattati con Algatan® e rappresenta la diversità ecologica tra i microbiomi delle due popolazioni. Il presente studio analizza la Diversità Beta utilizzando gli indici Unifrac Jackard e Bray Curtis, ponderati e non ponderati. Il Grafico 4 evidenzia le differenze tra i due gruppi di animali nella struttura della comunità batterica intestinale, attraverso un’analisi dei componenti principali (il gruppo di controllo in blu e il gruppo trattato in rosso). Sono state identificate differenze strutturali significative (Permanova e Anosim, p <0,05). L’uso del prebiotico ha avuto un’influenza significativa sul microbioma del cieco degli animali trattati, modulando non solo la comparsa di alcune specie e generi batterici, ma anche l’abbondanza relativa dei gruppi tassonomici comuni a entrambi i gruppi di animali.

Studio dei profili tassonomici

Una volta dimostrato l’effetto sulla struttura della comunità microbica, sono state analizzate in dettaglio le differenze osservate in specifici gruppi, a diversi livelli tassonomici, in seguito alla modulazione apportata dal trattamento con il prebiotico. Sono stati identificati cambiamenti significativi all’interno di specie batteriche benefiche o dannose per la salute e l’integrità intestinale (ANCOM e Kruskal Wallis, p<0,05). Nel cieco dei polli, una delle funzioni metaboliche più importanti è la fermentazione di polisaccaridi non digeribili, per produrre acidi grassi a catena corta, che possono essere assorbiti dalle cellule epiteliali. La Tabella 1 descrive gli effetti metabolici di alcuni dei taxa più importanti presenti nel microbiota del cieco dei polli.
Nel Grafico 5 sono rappresentate le abbondanze relative nel microbioma del cieco di polli trattati e non trattati con Algatan® dei taxa descritti in Tabella 1.

Conclusioni

Il prebiotico Algatan® ha aumentato in modo significativo l’abbondanza relativa di taxa batterici benefici per la salute intestinale e la crescita dei polli (Grafico 5). Questi taxa sono classificati in diversi livelli tassonomici, hanno funzioni metaboliche differenziate che possono essere correlate a un’azione integrale più completa ed equilibrata per il mantenimento dell’eubiosi intestinale.


In particolare, nei vari livelli, sono stati evidenziati aumenti di: firmicutes, lactobacillaceae, lachnospiraceae, clostridia, oscillospira, megamonas, faecalibacterium, bifidobacterium e la relazione tra firmicutes e bacteroidetes.
Inoltre è diminuita in modo significativo l’abbondanza di taxa batterici ritenuti dannosi per la salute intestinale e la crescita di polli, come quelli appartenenti all’ordine Campylobacterales e al phylum Proteobacteria.
È stato anche evidenziato l’aumento dell’abbondanza di batteri appartenenti alla famiglia delle Enterobacteriaceae, ritenuta dannosa.
All’interno dell’ordine Campylobacterales spicca la significativa riduzione dell’abbondanza della specie Campylobacter jejuni. Questo risultato potrebbe essere utile per ridurre la presenza di questo batterio nell’intestino dei polli da carne e, di conseguenza, sulla superficie delle carcasse del macello, come richiesto dal regolamento UE 2017/1495 della Commissione.
Gli effetti benefici che sono stati dimostrati nel microbioma intestinale dei polli da carne con l’uso del prebiotico Algatan® dovrebbero essere valutati anche attraverso un’analisi costo-beneficio del suo utilizzo nella produzione di pollame da carne.
Infine, questo studio può essere considerato come un modello per condurre nuove ricerche sul microbioma dei polli da carne, sugli effetti che possono essere ottenuti in esso con vari tipi di additivi (prebiotici, probiotici, enzimi, acidi organici con azione benefica, ecc.) o semplicemente con modifiche alla formula del mangime. L’obiettivo finale è quello di dare all’industria avicola un nuovo strumento, una fonte di dati che fornisca informazioni per migliorare la salute intestinale, il benessere e la crescita degli animali, contribuendo a ridurre il ricorso ai prodotti antimicrobici.

Pubblicato per la prima volta su Albèitar, n.02, 2020

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