L’RNA di influenza A presente nelle acque reflue può avere origine umana o animale. Il Centro comune di ricerca (JRC) della Commissione europea ha messo a punto un metodo di PCR digitale che combina più bersagli molecolari per distinguere i virus aviari H5 del clade 2.3.4.4b dai ceppi stagionali.
L’analisi delle acque reflue può segnalare in anticipo la circolazione dei virus influenzali. I comuni test molecolari per l’influenza A, però, riconoscono sia i virus stagionali umani sia quelli aviari. Quando entrambi sono presenti nello stesso campione, diventa difficile capire quanta parte del segnale si debba all’uno o all’altro. La direttiva europea 2024/3019 sul trattamento delle acque reflue urbane chiede agli Stati membri di stilare un elenco di parametri di salute pubblica da monitorare nei reflui, che può comprendere anche i virus influenzali.
Il metodo è stato sviluppato dai ricercatori del JRC insieme all’Istituto Superiore di Sanità, all’Università di Milano-Bicocca e al Laboratorio di referenza dell’UE per l’influenza aviaria e la malattia di Newcastle, che ha sede presso l’Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie. Si basa sulla RT-PCR digitale (RT-dPCR) e prevede due saggi duplex distinti: il primo comprende le componenti per l’influenza A e B del saggio CDC Flu SC2, il secondo è il duplex JRC-HA/JRC-MP. JRC-HA ha come bersaglio una regione conservata del gene dell’emoagglutinina dei virus H5 ad alta patogenicità del clade 2.3.4.4b. JRC-MP punta invece a una regione conservata del gene della matrice e riconosce una gamma più ampia di virus dell’influenza A, compresi i ceppi stagionali umani.
Per la valutazione i ricercatori hanno utilizzato virus H5N1 del clade 2.3.4.4b provenienti da uccelli selvatici e pollame del Nord Italia, raccolti tra ottobre e dicembre 2025. Il limite di rilevabilità è risultato di cinque copie di RNA per reazione. Le prove sono poi proseguite su estratti di RNA da reflui ai quali erano state aggiunte quantità note di RNA di influenza aviaria e stagionale.
In uno degli scenari sperimentali, JRC-HA ha rilevato l’RNA aviario a concentrazioni di 10 o 20 copie/µl nonostante la presenza di 3.500 copie/µl di RNA di influenza A stagionale. Nelle stesse condizioni JRC-MP ha reagito sia con l’RNA aviario sia con quello stagionale. La sua reattività più ampia serve a confermare la presenza di influenza A, ma ne riduce la specificità quando le concentrazioni di virus stagionale sono elevate.
La lettura dei risultati
I ricercatori propongono di interpretare i bersagli molecolari nel loro insieme, guardando a quali risultano positivi e all’intensità relativa dei segnali. Una positività a JRC-HA indica la presenza di materiale genetico riconducibile ai virus H5 del clade 2.3.4.4b. Se invece risultano positivi solo i saggi generici per l’influenza A, l’informazione è meno specifica: l’RNA può provenire dall’influenza stagionale oppure da virus aviari che JRC-HA non riconosce. Alcune combinazioni di risultati possono inoltre far pensare a una circolazione contemporanea di ceppi stagionali e aviari.
Quando le concentrazioni sono vicine al limite di rilevabilità serve particolare cautela. Sui valori misurati possono incidere le modalità di escrezione del virus, gli apporti che arrivano in fognatura, le caratteristiche della matrice e le differenze tra i metodi di laboratorio. Con prelievi ripetuti nel tempo, l’andamento dei dati può offrire elementi in più, a patto che campionamento e analisi seguano sempre le stesse procedure.
Il materiale genetico virale può arrivare in fognatura sia con gli scarichi domestici sia da fonti di origine animale. Negli Stati Uniti, tra maggio e luglio 2024, i CDC e le autorità sanitarie locali hanno cercato di risalire alla provenienza delle rilevazioni di H5 nei reflui. In 15 dei 24 siti positivi sono state individuate possibili fonti animali nel bacino servito dall’impianto o nella contea, in otto casi legate alla lavorazione del latte. Tra le altre segnalate figuravano impianti di lavorazione delle carni, allevamenti di bovini da latte, uccelli selvatici e allevamenti avicoli. I test molecolari rilevano soltanto l’RNA e non stabiliscono se sia presente virus infettante né quale specie lo abbia immesso in fognatura. Per questo i risultati vanno letti insieme ai dati delle indagini sanitarie negli allevamenti avicoli, della sorveglianza sugli uccelli selvatici e del monitoraggio dell’influenza nell’uomo.
Le prove con il virus aviario sono state condotte su materiale di origine animale e su reflui addizionati in laboratorio. Secondo il JRC, il metodo è già impiegato nella sorveglianza delle acque reflue in Lombardia. Il suo comportamento in condizioni ambientali diverse resta da verificare sul campo.
Test più specifici sui reflui potrebbero aiutare i servizi veterinari a decidere dove approfondire le indagini. Un sospetto di infezione in un allevamento avicolo andrebbe comunque confermato con campionamenti e analisi diagnostiche sugli animali.
Fonti
- Paracchini V. et al. (2026). Differentiating Avian and Seasonal Influenza Viruses in Wastewater by Digital PCR. Emerging Infectious Diseases, 32(11). https://doi.org/10.3201/eid3211.261234
- European Commission, Joint Research Centre (2026). New JRC laboratory method strengthens Europe’s early-warning system for bird flu. 21 ottobre 2026. Comunicato JRC
- Louis S. et al. (2024). Wastewater Surveillance for Influenza A Virus and H5 Subtype Concurrent with the Highly Pathogenic Avian Influenza A(H5N1) Virus Outbreak in Cattle and Poultry and Associated Human Cases — United States, May 12–July 13, 2024. MMWR, 73(37), 804–809. Report CDC
- Direttiva (UE) 2024/3019 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 27 novembre 2024, concernente il trattamento delle acque reflue urbane (rifusione). EUR-Lex
